- Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng
hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn.
- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp
pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn.
- Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệ
t độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu
được sản lượng pectinase cao.
- Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra
mô hình tối ưu.
- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời
gian phân hủy cơ chất và xác
định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym.
- Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm
enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ENZYM PECTINASE
1.1.1. Giới thiệu chung
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt
pectin của những enzym này. [44]
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi
sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã
chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau
(Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). [44]
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu
hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre,
1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies,
1999; Gognies, 2001) [44]
Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid
galacturonic, galactose, methanol… Đ
ây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và
protease. [9]
Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có
nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym
pectinesterase.[16]
Nhiệt độ tối ưu của enzym pectinase thường khoảng 45-55
0
C[52]
1.1.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
Nghiên cứu trong nước
Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về
cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng
chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.
Nghiên cứu ngoài nước
Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều
hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí.
Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác
nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea
(Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001),
Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được
nghiên cứu nhi
ều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;
Taragano, 1997; Caltisho, 2000). [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48]
Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật
dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999;
Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của
các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng
Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997)
đã “ Cải thiện
việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . [20], [23], [39], [46]
Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy
khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis-
Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung
pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic
hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [18], [27], [31], [32], [45], [48]
Theo thời gian ngu
ồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym
pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ
sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000,
trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của
Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường
nuôi cấy như
: pectin và glucose, pectin và glycerol, gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các
phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase
(Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37]
1.1.3. Cơ chất của enzym pectinase
Pectin là cơ chất của enzym pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới
thực vật.
Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các
acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin
gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl
*
của acid galacturonic có thể được
ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na
+
,
K
+
hoặc NH
4
+
, hay bị decacboxyl hoá …[30]
Công thức nguyên của acid galacturonic: C
6
H
10
O
7
Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình
1.1.
Hình 1.1:
Cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo của pectin
Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid
pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). [30]
Protopectin
Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid
pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được
tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). [30]
Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào
thự
c vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi,
protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. [16]
Acid pectic ( acid polygalacturonic)
Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng
muối của acid pectic gọi là pectat.
Acid pectinic
Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của
acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là
hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng
methyl vừa đủ thấp)[30]
Pectin
Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp g
ồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic
là thành phần chủ yếu. [30]
Bảng 1.1
: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55]
Trái cây
Hàm lượng pectin
(% trọng lượng tươi)
Táo 0,71-0,84
Chuối 0,59-1,28
Cà rốt 1,17-2,29
Nho 0,09-0,28
Bưởi 3,30-4,50
Chanh 2,80-2,99
Cam 2,34-2,38
Mơ 0,71-1,32
1.1.4. Phân loại[30]
Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính:
- Pectinesterase
- Các emzim khử mạch polymer
- Protopectinase
Sơ đồ 1.1
: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30]
1.1.5. Cơ chế hoạt động của enzym pectinase
Trung tâm hoạt động của enzym pectinase
Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải;
trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động
của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm
gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh h
ưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. [53]
1.1.5.1. Pectinesterase(PE)
Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl
của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid
galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [30]
Pectinase
Pectinesterase
Emzim khử polymer
Protopectinase
PMG PG
PE PE PE
Hydrolase Lyase
PMGL PGL
Endo
-
PMG
Exo
-
PMG
Endo
-
PG
Exo
-
PG
Endo
-
PMGL
Endo
-
PGL
Exo
-
PGL
Exo
-
PMGL
Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) [13]
1.1.5.2. Protopectinase
Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. [30]
1.1.5.3. Các enzym khử mạch polymer
Chia làm 2 tiểu nhóm:
a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)
Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin
có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:
- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.
Hình 1.3
: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13]
-Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin
Hình 1.4
: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]
Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid
polygalacturonic), gồm 2 loại:
- Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên
liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic
Endo-PMG
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
Exo-PMG
COOCH
3
Hình 1.5
: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13]
- Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt
liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.
Hình 1.6:
Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)[13]
b. Enzym cắt (Lyase):
Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con
đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase.
Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra như sau: các
pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm
cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao
các proton đến các oxy glycosidic,
để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5.[69]
COOH
COOH
Endo-PG
COOH
COOH
COOH
Exo-PG
COOH
Hình 1.7
: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin [69]
Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:
Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với
pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:
- Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-
glycosid của pectin.
- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.
Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại:
- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-
glycosid của acid pectic.
- Exo- PGL: còn gọ
i là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-
glycosid của acid pectic từ đầu không khử.
1.1.6. Ứng dụng pectinase
Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase
kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây,
rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong
chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nướ
c thải, lên men trà, cà phê. [30]
Bảng 1.2
: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật
Vi sinh vật Loại pectinase
Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase
Exo-pectinase
Penicillium frequentans
Endo-PG
Sclerotium rolfsii
Endo-PG
Pectinases acid
Rhizoctonia solani
Endo-PG
Rhizoctonia solani
Endo-PG
Mucor pusilus PG PG
Clostridium thermosaccharolyticum
Polygalacturonate hydrolase
Bacillus sp. RKG PGL
Bacillus sp. NT-33 PG
Bacillus polymxa
PG
Bacillus pumilis
PATE
Amuloca sp.
Pectate lyase
Bacillus sp. P-4-N PG
Penicillium italicum
PMGL
Bacillus sp. DT7 PMGL PMGL
Pectinases kiềm
Bacillus subtilis
PAL
(Nguồn: Kashyap et al., 2001)
1.1.6.1. Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang
Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang. Pectinase được bổ
sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép và làm trong nước ép trái cây. Trong công nghiệp nước ép
trái cây, người ta thường tạo ra hai loại nước ép là nước ép trong và nước ép đục (hay purée). Phương
pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục
được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như
cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm
chuối,
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét