5
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp. carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN
(Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn:
Thầy Lê Đình Đôn
Thầy Dƣơng Thành Lam
Địa điểm: Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích
Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên địa lan
(Cymbidium). Hiện nay, các vƣờn địa lan tại thành phố Đà Lạt bị thiệt hại rất lớn do bệnh
thối làm chết cây gây ra. Cho đến thời điểm này ngƣời ta vẫn chƣa xác định chính xác tác
nhân gây ra bệnh và chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu. Do đó, việc tìm hiểu phƣơng
pháp chẩn đoán, phát hiện tác nhân gây ra bệnh là hết sức cần thiết giúp xây dựng quy
trình phòng trừ bệnh hiệu quả hơn.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vƣờn trồng địa lan trên địa bàn TP.
Đà Lạt – Lâm Đồng.
2. Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan.
3. Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
4. Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate
lyase của vi khuẩn bằng phƣơng pháp PCR.
Kết quả đạt đƣợc:
1. Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra:
- Bệnh do vi khuẩn: 20,17%.
- Bệnh do virus: 9,5%.
- Bệnh do nấm: 11,6%.
2. Phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng:
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
3. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan:
6
- Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh
(ở nhiệt độ phòng).
- Trên lá địa lan: hầu nhƣ các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10
ngày (ở 25
0
C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh.
4. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của
các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
7
MỤC LỤC
Phần Trang
Trang tựa ii
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – yêu cầu 1
1.2.1. Mục đích 1
1.2.2. Yêu cầu 1
1.2.3. Giới hạn 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Điều kiện tự nhiên của TP. Đà Lạt với việc
nuôi trồng Cymbidium 3
2.2. Giới thiệu về lan Cymbidium 3
2.2.1. Phân loại – phân bố 3
2.2.2. Đặc điểm thực vật học 4
2.2.3. Yêu cầu sinh thái 5
2.2.4. Sâu bệnh 5
2.2.5. Tình hình sản xuất lan Cymbidium của Tp. Đà Lạt
và trên thế giới 7
2.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora và tác hại của nó 8
2.3.1. Phân loại 8
2.3.2. Erwinia carotovora 8
2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora 9
2.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra 13
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
8
3.1. Vật liệu thí nghiệm 17
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17
3.1.2. Vật liệu 17
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan
tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng 18
3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn 18
3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB
và môi trƣờng YDC 19
3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 19
3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng 21
3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 21
3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR 22
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng 25
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan 25
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra 27
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn 28
4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 29
4.3.1. Trên môi trƣờng KB 29
4.3.2. Trên môi trƣờng YDC 30
4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 31
4.4.1. Trên củ khoai tây 31
4.4.2. Trên lá địa lan 32
4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 32
4.6. Phản ứng PCR 34
4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 34
9
4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer
Erw1 và Erw2 35
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
5.1. Kết luận 37
5.2. Đề nghị 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 38
10
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PCR : Polymerase chain reaction
DNA : Deoxyribonucleotide acid
RNAse : Ribonuclease
TE : Tris EDTA
SDS : Sodium dodecyl sulfate
NaCl : Natri clorua
TAE : Tris Acetate EDTA
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
Taq : Thermus aquaticus
UV : Ultra violet
LB : Luria – Bertani
KB : King et al. 's medium B agar
CVP : Crystal violet - pectate
PGA : Potato Glucose Agar
EtBr : Ethidium bromide
YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO
3
Ecc : Erwinia carotovora subsp. carotovora
CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide
T
m
: Melting temperature
ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay
μl : micro lít
μg : micro gam
μM : micro mol / lít
mM : mili mol / lít
ctv : cộng tác viên
ha : hecta
ng : nano gam
bp : base pair
11
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora 8
Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan 25
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành 26
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa 26
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh
trên môi trƣờng PGA 29
Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB
chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30
Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC
sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây
chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) 31
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan
chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 25
0
C) 32
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh
sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA 32
Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 33
Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 56
0
C) 34
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer
Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 58
0
C) 34
Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 35
12
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
BẢNG TRANG
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra 27
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm
gây ra qua các vƣờn điều tra 28
13
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium. Ngƣời
dân Đà Lạt thƣờng gọi lan Cymbidium là địa lan. Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng
loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc. Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu
những năm trƣớc 1990. Mặc dù có những biến động bất lợi về thị trƣờng tiêu thụ hoa cắt
cành nhƣng gần đây, việc nuôi trồng hoa lan với quy mô lớn nhằm mục đích khai thác
kinh doanh đã dần dần đƣợc khôi phục. Hoa địa lan Cymbidium đƣợc nhiều ngƣời quan
tâm và đầu tƣ với quy mô lớn.
Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt
đang phải đối mặt với bệnh thối làm chết cây. Bệnh phát triển nhiều và lây lan nhanh
chóng trong mùa mƣa. Hiện nay, tình trạng bệnh chết cây địa lan vẫn chƣa đƣợc khống
chế do chƣa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chƣa tìm ra loại thuốc đặc trị hữu
hiệu. Thiệt hại về kinh tế do căn bệnh này gây ra là rất lớn. Đây là nỗi trở ngại, băn khoăn
của đa số các hộ trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt. Vấn đề đặt ra là làm sao xác
định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng đƣợc quy trình phòng trừ bệnh
hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho ngƣời trồng địa lan.
Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phát hiện vi
khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phƣơng
pháp PCR”.
1.2. Mục đích – yêu cầu
1.2.1. Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp.
carotovora trên cây địa lan (Cymbidium).
1.2.2. Yêu cầu
- Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng.
- Phân lập mẫu vi khuẩn.
- Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora.
- Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn.
14
- Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích
hợp để thiết lập quy trình PCR.
1.2.3. Giới hạn
- Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006.
- Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu.
- Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét