CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 5
sn xut ch phm enzim, ngi ta có th phân lp các ging vi sinh vt có trong t
nhiên hoc các ging t bin có la chn theo hng có li nht, ch tng hp u th
t loi enzim nht nh cn thit nào ó.
Chng 2: SN XUT CÁC CH PHM ENZIM T VI SINH VT
2.1. u hoà quá trình sinh tng hp enzim trong môi trng nuôi cy vi
sinh vt
i mc ích nuôi cy thu hi enzim vi hiu sut cao, cn phi nhn r quá trình u
hoà sinh tng hp enzim có các nh hng tác ng thích hp trong công ngh. T
bào vi sinh vt ch tng hp enzim khi cn thit vi s lng thích hp mong mun.
2.1.1. u hoà theo hng óng m bi gen operator (gen u khin) _hin
ng trn áp :
+ hin tng trn áp (c ch) (repression): là làm gim quá trình sinh tng hp do sn
phm cui cùng ca quá trình nuôi cy. Hin tng này thng gp i vi các enzym
xúc tác quá trình sinh tng hp mt chiu nh: quá trình sinh tng hp axit amin,
nucleotit.
Ví d: khi thêm mt axit amin nào ó vào môi trng nuôi cy thì t bào s không cn
ng hp này na. Do ó cng sình ch quá trình sinh tng hp enzym, xúc tác cho quá
trình tng hp nên chính axit amin ó. Enzym này chc tng hp tr li khi có nhu
u ngha là khi làm gim nng axit amin tng ng. i vi h thng phân nhánh
ngha là quá trình dn n vic to thành nhiu sn phm cui cùng khác nhau t mt c
cht chung ban u thì c ch trn áp có thc thc hin theo các cách khác nhau.
Ví d: Phn ng u tiên ca quá trình sinh tng hp các axit amin lizin, methionin,
treonin u do enzym aspactokinaza xúc tác. Enzym này có 3 izoenzim.
Ký hiu: a
l
, a
m
, a
t
. Quá trình sinh tng hp a
l
s b trn áp bi nng lizin. a
m
ca
methionin. Riêng i vi a
t
thì treonin va là sn phm cui cùng ca c quá trình va là
cht ban u sinh tng hp izolxin. Do ó quá trình sinh tng hp axit
t
ch b trn
áp khi c treonin và izolexin t nng cao vt quá nhu cu ca t bào. Có th minh
ho c ch trn áp này theo s:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 6
al
am
at
A B C D Methionin
E
G
Lizin
Treonin
Izoloxin
Ghi chú: A – C cht Aspartic ban u.
B, C, D, G là các sn phm trung gian có tác dng trn áp.
Nh vy ây s trn áp ch xy ra khi có s hp ng tác dng ca c 2 sn phm.
u trn áp hp ng này cùng xy ra i vi quá trình sinh tng hp enzym ging nhau
xúc tác cho các phn ng song song to thành 2 sn phm cui cùng khác nhau. Ví d:
quá trình sinh tng hp valin và izolxin do 4 enzym ging nhau xúc tác theo s sau:
Valin
Izoloxin
432
1
Hin nay ngi ta cho rng ARN mi là yu t trn áp thc s cho quá trình sinh tng
p các enzym xúc tác tng hp các axit amin tng ng.
+ Hin tng cm ng (induction): là hin tng ngc li vi hin tng trn áp làm
ng lng enzym ca t bào
(Ghi chú s trên: 1: -axeto.-oxyaxítintetaza
2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza)
3: hydrooxyaxit dehydrataza
4: amino transpheraza
4 Phn ng
4 Phn ng
6 Phn ng
-axetolactat
-axeto
-Oxybutirat
-Dioxy
metylvalerat
-Xeto
- metyl
-Xeto
izovalerat
-Dioxy
izovalerat
CH
3
CHO
hot ng
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 7
Ngha là khi trong môi trng nuôi cy có cht cm ng s kích thích cho vi sinh vt
sinh tng hp nên nhiu enzym hn so vi bình thng.
Cht cm ng c xem nh là mt cht nn (Cht c s, b khung cácbon) sinh
ng hp enzym. Hin nay, ngi ta ch ra rng có th các sn phm trung gian ca quá
trình bin i óng vai trò là cht cm ng, thm chí nhiu c cht ca enzym cng có
th là cht cm ng. n hình là các gluxit (monosaccarit và polysaccarit).
Trong s các enzim do vi sinh vt tng hp, có nhng enzim bình thng chc
ng hp rt ít i nhng khi thêm mt s cht nht nh vào môi trng nuôi cy thì hàm
ng ca chúng có th tng lên rt nhiu ln. Monod và Cohn (1925) gi các enzim này
là enzim cm ng, cht gây nên hiu qu này là gi là cht cm ng. Các enzim cm ng
thng là nhng enzim xúc tác cho quá trình phân gii nh: Proteinaza, amylaza,
pectinaza, penixilinaza, _galactosidaza t bào E. coli. Khi nuôi cy E. coli trong môi
trng glucoza và glyxerin, vi khun ch tng hp khong 10 phn t_galactosidaza/t
bào. Nu nuôi cy trên môi trng lactoza là ngun các bon duy nht thì hàm lng
enzim là 6÷7% tng hp lng protein ca t bào. Trích ra t t bào cha n 6000 phn
enzim, ngha là tng lên gn 1000 ln so vi khi nuôi cy trong môi trng c.
cm ng thng có tính cht dây chuyn. Trong h thng gm nhiu phn ng, c
cht u tiên ca h thng có th cm ng quá trình sinh tng hp tt c các enzim xúc
tác cho quá trình chuyn hoá ca nó. u này c thc hin theo c ch sau: Trc ht
cht cm ng làm tng quá trình sinh tng hp enzim tng ng, sau ó sn phm này li
m ng tng hp enzim phá hu nó, tip theo sn phm th 2 này li cm ng tng
p nên enzim th 3,…
Ví d: Histidin có tác dng cm ng hàng lot các enzim xúc tát cho quá trình chuyn
hoá nó thành axít glutamic (Chasin và Magasamil (1968)).
+ C chu hòa theo kiu trn áp và cm ng:
Zocob và Monod ã ra mô hình gii thích c ch ca 2 hin tng trn áp và cm
ng trên c s di truyn. Theo mô hình này, s trn áp và cm ng sinh tng hp enzim
c thc hin theo cùng mt c ch chung da trên c su hoà hot ng ca các
gene di tác dng ca các cht phân t thp. Nhng cn c chính ca thuyt này nh
sau:
1) Có s phân hoá chc nng ca các giai n khác nhau trong phân t AND trong
nhim sc th, da vào chc phn ca chúng trong qui trình sinh tng hp Protein có th
chia thành các loi gene sau:
- Gene cu trúc (ký hiu: S
1
,S
2
,S
3
) : mã hoá phân t protein enzim c tng hp, tc
là th t các axit amin trong phân t enzim c tng hp là tu thuc vào th t các
nucleotit ca n gene này. Các gene mã hóa các enzim c íp xp lin nhau thành
t nhóm trên nhim sc th. Chúng là khuôn tng hp phân t ARN
tt
.
- Gene Operator (ký hiu: O): cnh nhóm gene cu trúc, không mã hoá protein
nhng m bo cho quá trình sao chép mã gene cu trúc theo c ch “óng m” ta
nh công tc ca mt dây èn. Quá trình sao chép ch có th tin hành khi gene operator
trng thái “m” (không kt vi cht nào c) và ngng li khi nó b “óng” (kt hp vi
t cht c bit gi là cht trn áp represson). Mt gene operator có th “ph trách” mt
nhóm gene cu trúc các gene cu trúc này cùng vi gene operator ca chúng hp thành
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 8
t n v sao chép s cp gi là mt operon. S tng hp ARN
tt
c bt u mt
u ca operon và chuyn qua các gene cu trúc n u kia ca operon.
- Gene Promotor (gene hot hoá ký hiu P) ng trc gene operator là n And mà
ARN-polimeraza s kt hp và bt u quá trình sao chép các gene cu trúc.
- Gene u hoà regulator (ký hiu R): Gene này mã hoá cho mt protein c bit gi
là cht trn áp (repressor). Cht trn áp có vai trò “óng-m” gene operator. Do ó gene
u hoà có th kim tra quá trình sao chép gene cu trúc thông qua cht trn áp này.
+ Không có repressor (sn phm cui cùng)
R P O S1 S2 S3 ADN
E3E2E1
A BC
D
ARNtt
+ Có repressor (sn phm cui cùng):
Phiên mã
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 9
R P
O S1 S2 S3
ADN
: ARN-polymeraza
: Repressor
: coreressor
R: Gene u hoà, P: Gene promotor, O: Gene Operator,
S1, S2, S3: Các gene cu trúc.
2) Trong trng hp u hoà sinh tng hp enzim theo c ch trn áp, repressor do
gene u hoà tng hp còn dng không hot ng (aporepessor) cha có kh nng kt
p vi gene operator nên quá trình sao chép các gene cu trúc tin hành bình thng.
Các enzim c tng hp xúc tác cho các phn ng to thành các sn phm cui cùng,
n phm cui cùng này li có kh nng kt hp vi aporepessor và hot hoá nó.
Aporepessor ã c hot hoá s kt hp vi operator ngn cn quá trình sao chép các
gene cu trúc, làm ngng vic tng hp ARN
tt
tng ng do ó ình ch quá trình sinh
ng hp các enzim tng ng. Trong trng hp này các sn phm mi c coi nh là
cht trn áp (repressor).
3) i vi trng hp cm ng:
+ Không có cht cm ng
R P O S1 S2 S3 ADN
+ Có cht cm ng:
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 10
ADNS3S2S1OPR
ARNtt
A
BC D
E1
E2 E3
minh ho c ch cm ng sinh tng hp enzim
: Cht cm ng
Khi không có mt cht cm ng, cht trn áp (repressor) c tng hp ã trng thái
hot ng, nó kt hp vi gene u khin operator, quá trình sao chép mã ca gene cu
trúc b bao vây nên các enzim tng ng không c tng hp.
Khi có mt cht cm ng thì cht trn áp repressor b mt hot ng, tách khi gene
u khin operator và quá trình sao chép mã bt u, kt qu làm tng lng enzim c
ng hp.
Nh vy ta thy hin tng trn áp và cm ng sinh tng hp enzim là hai mt i lp
a mt quá trình hoá sinh thng nht c thc hin thông qua hot ng “óng-m”
gene di tác dng ca các cht phân t thp
2.1.2. u hoà tng tác gia ARN-polymeraza vi gene promotor:
Nhiu du hiu thc nghim cho thy các gene bo m sinh tng hp mt s enzim
m ng xúc tác cho quá trình phân gii không ch chu s kim tra theo c ch cm ng
nhã trình bày trên mà còn chu s kim tra theo mt c ch khác nh tác dng ca
AMP vòng (AMP
v
) gi là “trn áp phân gii” (cactabolic repressor) AMP
v
có tác dng
kích thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã ca các operon phân gii. Hin tng
này ã c nghiên cu nhiu i vi operon lactoza. Theo nhiu tác gi, tác dng kích
thích ca AMP
v
i vi quá trình sao chép mã c thc hin nh mt protein c bit
làm trung gian gi là protein nhn AMP
v
, hay còn gi là protein hot hoá gene phân gii
CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMP
v
kt hp vi CAP to thành phc hp
có tác dng hot hoá gene promotor làm cho ARN-polymeraza d dàng kt hp vi nó
t u quá trình sao chép mã. Nh vy AMP
v
có tác dng làm tng cng quá trình sao
chép. Cng có ý kin cho rng phc hp AMP
v
-CAP-ARN-polymeraza cho phép bt u
quá trình sao chép mã.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 11
CAP
P
O Zi
i ZO
ARN-Polymeraza
CAP
a)
b)
c)
i ZO
CAP
AMPv
AMPv
AMPv
ARN
Pol
Pol
ARN
CAP
O Z
i
d)
ARNtt
Mô hình bt u sao chép mã ca operon lactoza
a – Phc hp CAP-AMP
v
chun b kt hp vào min c bit ca ADN.
b – Sau khi phc CAP-AMP
v
kt hp vào, nó làm yu n ADN.
c - ARN-polymeraza kt hp vào min c bit ca nó.
d - ARN-polymeraza “trc” dc theo n ADN nh mt “cái bt” n min bt u.
Ngi ta cng nhn thy glucza và mt s loi ng khác khi thêm vào môi trng
nuôi cy vi khun thng làm giàu lng AMP
v
trong t bào, do ó làm gim quá trình
sinh tng hp nhiu enzim cm ng, ngay c khi nó có cht cm ng trong môi trng.
Hin tng này còn gi là “hiu ng glucoza” c quan sát thy E. coli và mt s vi
khun. Tuy nhiên cho n nay vn cha bit rõ c ch làm giàu AMP
v
do glucoza và các
ng khác
2.2. Tuyn chn và ci to ging vi sinh vt cho enzim có hot lc cao:
chn ging vi sinh vt có kh nng sinh tng hp enzim cao, ngi ta có th phân
p t môi trng t nhiên hoc có th dùng các tác nhân gây t bin tác ng lên b
máy di truyn hoc làm thay i c tính di truyn to thành các bin chng có kh
ng tng hp c bit hu hiu mt loi enzim nào ó, cao hn hn chng gc ban u.
2.2.1. Phng pháp gây t bin:
ây là phng pháp hay c dùng nht nhm :
- To nhng t bin b gim kh nng sinh tng hp repressor hoc tng hp
repressor có ái lc thp vi gene opertor.
- To nhng t bin tng hp enzim có cu trúc bc 1 thay i do ó có th gim
thay i vi kiu kìm hãm theo c ch liên h ngc.
u vào
Min bt u vào
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 12
u s thay i cu trúc bc 1 xy ra vùng trung tâm hot ng hoc gn ó thì có
th làm thay i rõ rt hot tính ca enzim.
- Gây t bin n gene hot hoá promotor làm tng áp lc ca nó i vi ARN-
polymaraza do ó làm tng tc sao chép mã Dùng bin pháp này có th làm tng
ng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 ln.
Hin tng t bin thng liên h vi s thay i mt gene, chng hn b “li” mt
baz khi tái to phân t ADN. Ví d mt v trí nào ó trên gene có th t nucleotit là
G-X, nu nó b thay th bng A-T, T-A hoc X-G thì phân t ARN
tt
c tng hp trên
n gene b li này cng s khác vi ARN
tt
bình thng v trí tng ng vi ch “li”
trên gene. Do ó s tng hp nên phân t enzim khác vi bình thng mt s gc axít
amin.
to mt t bin gene có th dùng tác nhân vt lý (tia t ngoi, tia phóng x) hay
hoá hc (các hoá cht) tác dng lên t bào sinh vt.
2.2.2. Phng pháp bin np:
Là s bin i tính trng di truyn ca mt nòi vi sinh vt di nh hng ca ADN
trong dch chit nhn c t t bào ca vi sinh vt khác. ây yu t bin np là ADN.
chuyn vt liu di truyn (ADN) t t bào cho n t bào nhn có th xy ra trong ng
nghim (invitro) khi cho t bào nhn tip xúc vi dch chit t t bào cho mà không có s
tip xúc gia các t bào.
Các t bào có th nhn bt k loi ADN nào ch không òi hi phi là ADN t các
ging h hàng. Tuy nhiên t bào ch có th nhn mt sn ADN nht nh, thng
không quá 10 n. Các n ADN c di truyn trong bin np có M=10
6
-10
7
và phi
có câu trúc xon kép. T bào không tip nhn các n ADN có kích thc nh hn hoc
các n không có cu trúc xon kép. Hin tng bin np ph bin nhiu loài vi sinh
t nh: Diplococus, Staphylococus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,
Xantomonas.
2.2.3. Phng pháp tip hp gene:
Khác vi bin np, ây vt liu di truyn chc truyn t t bào cho n t bào
nhn khi hai t bào tip xúc vi nhau. Do vy các vi sinh vt có kh nng bin np thì s
không có kh nng tham gia tip hp gene na. Hin nay quá trình tip hp gene ã c
nghiên cu mt s loài vi khun nh E. coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.
2.2.4. Phng pháp ti np:
t liu di truyn (ADN) c chuyn t t bào cho sang t bào nhn nh vai trò trung
gian ca thc khun th (phage). Trong quá trình ti np, các n ADN c chuyn t
bào cho n t bào tip hp vi ADN ca t bào nhn. Do ó làm bin i tính cht di
truyn ca t bào nhn.
2.3. Phng pháp bo qun ging vi sinh vt :
Khi s dng vi sinh vt sn xut enzim cn chn ging thun chng, ã c kim
tra y v các c tính hoá sinh, vi sinh, nuôi cy và cn c bit lu ý n u kin
o qun ging. Thc t khi bo qun ging gc trong mt thi gian dài có th to ra các
bin d ngu nhiên không mong mun do ó nh k phi cy chuyn và kim tra li các
c tính ban u.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 13
2.3.1. Phng pháp cy chuyn:
ây là phng pháp ph bin nht d thc hin bng cách gi ging trên môi trng
thch (thch nghiêng, hp petri,…) vi thành phn môi trng nuôi cy và u kin nuôi
y thích hp cho ging vi sinh vt ó. Sau khi ging ã mc tt cn bo qun nhit
nh 3-4
0
C và sau mi tun phi cy chuyn li. Khi cy chuyn ch ly bào t hoc
khun lc mà không nên ly c môi trng dinh dng bo m không chuyn các sn
phm trao i cht vào môi trng mi (có th gây nên nhng bin i bt li không th
ng ht c). Nu là x khun thì không nên bo qun ging trên môi trng thch
mà nên gi trong t ã kh trùng.
kéo dài thi gian bo qun ging t hàng tháng n 1 nm, ngi ta ph mt lp
paraphin lng ã tit trùng trên b mt ging hn ch s phát trin ca nó. Cn lu ý
ch ph lp du sau khi cy vi sinh vt t n chín sinh lý.
Phng pháp cy chuyn rt có hiu qu bo qun các ging nm men, vi khun và
t hu hiu, d dàng trin khai ging ra sn xut ln, hn ch các tai bin có th dn n
hng ging gc.
2.3.2. Phng pháp làm khô:
ng cách gi ging trên cát, t, silicagen trong u kin khô ráo (tt cu c
kh trùng cn thn). Trong u kin nh vy s hn ch s phát trin tip tc ca ging
khi bo qun. Phng pháp này rt hay c s dng bo qun nm mc, x khun,
t vài loài nm men, vi khun thi gian gi ging có thc 1 nm.
Phng pháp làm khô cng thc hin n gin, không cn dng ct tin. Tuy nhiên
ging nh phng pháp cy chuyn thi gian bo qun tng i ngn.
2.3.3. Phng pháp ông khô:
c là làm khô bng sy chân không thng hoa (nêu nguyên tc), còn gi là sy lnh
to nên sn phm ông khô (thc phm ông khô, các vt phm sinh hc, y hc ông
khô…). ây là phng pháp bo qun lâu dài n 10 nm mà không làm cho ging b
bin i c tính nhng òi hi công ngh cao, thit bt tin, chi phí bo qun ln.
n na mt s loài vi sinh vt nh nm mc không có bào t và mt s loi vi rút t ra
không thích hp khi bo qun ông khô.
2.3.4. Phng pháp làm lnh ông trong nit lng:
Khí nit hoá lng nhit rt thp -165
0
C n -196
0
C nên nu bo qun vi sinh vt
môi trng này s rt tt vì ging c gi bt bin trên 10 nm. Tuy nhiên ây là lnh
c công ngh cao (cn nit nguyên cht và lnh thâm ) nên chi phí bo qun rt cao.
2.4. Môi trng nuôi cy vi sinh vt sinh tng hp enzim:
ây là yu tu tiên nh hng trc tip n hot ng sng cng nh kh nng sinh
ng hp enzim ca vi sinh vt. Môi trng chn cha y các cht C, N, H, O. Các
cht vô c: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các cht vi lng khác.
2.4.1. Ngun cácbon:
Thng là hp cht hu c trong ó ch yu là gluxit, tu thuc vào c tính ca
enzim và nòi vi sinh vt mà ngi ta la chn cho thích hp.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim amylaza: ây là enzim cm ng n hình vì
y môi trng nuôi cy phi có các cht cm ng: tinh bt, dextrin, mantoza. Qua
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 14
nghiên cu ngi ta nhn thy ba loi gluxit là ngun cácbon tt nht sinh tng hp
amylaza t hiu qu cao. Chng hn hiu sut sinh tng hp trên môi trng gluxit khác
nhau vi mt s loi enzim amylaza nh sau:
+ i vi -amylaza:
Tinh bt > dextrin > mantoza > glucoza > saccaroza > galactoza > manit > avabinoza.
+ i vi Oligo-1,6-glucoridaza (dextrinaza):
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza > glucoza > lactoza > galactoza > orabinoza
> manit.
+ i vi -1,4-amyloglucoridaza :
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza, glucoza, lactoza, orabinoza > rabinoza >
lactoza > manit.
Khi nuôi cy theo phng pháp b mt nu dùng cám thì không cn b sung tinh bt,
ngun tinh bt rt ph bin, ngoài cám có th dùng bt ngô, bt mì, bo bo.
n chú ý trong a s trng hp, mt s loi ng, n hình nht là ng glucoza
i kìn hãm sinh tng hp các enzim thu phân nói chung (chng hn theo c ch trn áp
phân gii do làm giàu lng AMP
v
trong t bào).
i vi các h vi sinh vt sinh enzim Proteaza:
Có mt s ngun gluxit khi dùng nuôi cy nm mc có kh nng sinh tng hp enzim
Proteaza có hot lc cao, chng hn theo th t sau:
+ i vi Asp. Flavus 74: fructoza > glucoza > saccaroza > ramnoza > mantoza >
galactoza > orabinoza > lactoza.
+ i vi Asp. Awamori 200: fructoza > manit > saccaroza > orabinoza > galactoza >
lactoza.
+ i vi Asp. Oryae 79: fructoza > saccaroza > mantoza > glucoza > manit >
orabinoza > galactoza > lactoza.
Tinh bt là ngun cácbon ca nhiu chng vi khun sinh tng hp enzim proteaza. Ví
: Vi khun Bac. Subtilis có kh nng sinh tng hp proteaza môi trng tinh bt
>8%, ging x khun a nhit Micromonospora vulgaricus sinh tng hp proteaza trong
môi trng 0.15-0.25% tinh bt.
Ngoài ra mt s loi hydrocacbon cng có ngun cácbon cho 125 chng vi sinh vt.
Chng hn, mt s ging vi khun Pseudomonas semginosa có kh nng sinh tng hp
proteinaza hot lc cao trên môi trng n-paraphin vi 12, 14, 16 nguyên t C hoc
proplylenglycol, hydrocacbon thm.
- i vi các h vi sinh vt sinh enzim Pectinaza:
Quá trình sinh tng hp enzim pectinaza có liên quan n cht cm ng. ó chính là
pectin, ng nhiên ó là ngun cácbon. Nu s dng hn hp gluxit trong ó có pectin,
nuôi cy vi sinh vt thì hot lc ca pectinaza ngoi bào có th tng 4-6 ln so vi khi
nuôi cy không có pectin.
Ging Asp. Niger c nuôi cy trên môi trng có nhiu ngun cácbon nh: Pectin,
tình bt, isulin, lactoza, saccaroza, mantoza, galactoza nng 2, 4, 6% s cho pectinaza
có hiu sut cao. Tuy nhiên nên nuôi cy trên môi trng ch có monosacarit và glyxerin
thì hoàn toàn không th sinh tng hp enzim này. ng glucoza có tác dng kìn hãm
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét